IVD行業(yè)常見的核酸提取方法及原理

發(fā)布時間:05-27 | 作者: | 來源:| 6147:次圍觀

1.核酸的基礎知識
核酸分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）,其中RNA又可以根據(jù)功能的不同分為核糖體RNA(rRNA),信使RNA（mRNA）和轉移RNA（tRNA）。
DNA主要集中在細胞核內(nèi),線粒體和葉綠體中,而RNA主要分布在細胞質當中


核酸中因為嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵,所以核酸具有紫外吸收的特性,DNA鈉鹽的紫外吸收在260nm附近,其吸光率以A260表示,在230nm處于吸收低谷,因此可以使用紫外分光光度計對核酸進行定量及定性測定。
核酸為兩性電解質,相當于多元酸,可以使用中性或偏堿性的緩沖液使核酸解離成陰離子,置于電場中向陽極運動,這就是電泳的原理。
2.核酸提取純化原則和要求
＞保證核酸一級結構的完整性
＞排除其它分子的污染（如提取DNA時排除RNA的干擾）
＞核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和高濃度的金屬離子
＞盡可能降低蛋白質、多糖和脂類等大分子物質

3.核酸提取純化方法
＞酚/氯仿抽提法
1956年發(fā)明,通過酚/氯仿處理細胞破碎液或者組織勻漿后,在水相中主要溶解以DNA為主的核酸成分,在有機相中主要是脂類物質,蛋白質位于兩相之間。
＞醇沉淀法
乙醇能夠消除核酸的水化層,使帶負電荷的磷酸基團暴露出來,NA﹢等帶正電荷離子能與磷酸基團結合,形成沉淀。
＞層析柱法
通過特殊硅基質吸附材料,能夠特定吸附DNA,而RNA和蛋白質順利通過,然后利用高鹽低PH結合核酸,低鹽高PH值洗脫,來分離純化核酸。

＞熱裂解堿法
堿法提取主要是利用共價閉合環(huán)狀質粒與線性染色質在拓撲學上的差異來分離他們,在堿性下,變性蛋白是可溶的。
＞煮沸裂解法
加熱處理DNA溶液,利用線性DNA分子的特性,通過離心將DNA片段與變性蛋白質和細胞碎片形成的沉淀分離。
＞納米磁珠法
運用納米技術對超順磁性納米顆粒的表面進行改良和表面修飾后,制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。該磁珠能在微觀界面上與核酸分子特異性地識別和高效結合。利用氧化硅納米微球的超順磁性,在Chaotropic鹽(鹽酸胍、異硫氰酸胍等)和外加磁場的作用下,從血液、動物組織、食品、病原微生物等樣本中分離出DNA和RNA。
＞其他方法
除了上述常用的方法之外,還有超聲法、反復凍融法、酶解法及低滲裂解等等多種方法。

4.核酸提取類型
＞總RNA提取
總RNA中,75-85%為rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA),其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA,snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA,snoRNA）等組成。
＞miRNA提取
MicroRNAs (miRNAs)是小型的、高度保守的RNA分子,如小干擾RNAs (siRNAs),通過與他們的堿基配對調節(jié)其同源mRNA的分子表達,以預防通過各種機制的表達。他們已成為進行發(fā)育、細胞增殖、分化和細胞周期的重點監(jiān)管機構。
＞基因組DNA提取
進行基因結構和功能研究以及基因診斷,通常要求得到的片段長度不小于100～200kb。在DNA提取過程中應盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素,以保證DNA的完整性,為后續(xù)的實驗打下基礎。
＞質粒抽提
質粒抽提方法即去除RNA,將質粒與細菌基因組 DNA分開,去除蛋白質及其它雜質,以得到相對純凈的質粒。